外泌體介紹及提取方法

背景介紹：

剛發(fā)現外泌體時，這種比多泡體還要小的細胞外囊泡被視為細胞外排出的代謝垃圾，但隨著對這種細胞外囊泡不斷地深入研究，發(fā)現這種細胞外囊泡在細胞之間的通訊交流中發(fā)揮著極其重要的作用。

外泌體是什么？

外泌體是機體所有活細胞分泌的一種直徑約為30-150nm的細胞外囊泡，廣泛存在于各種生物體液（血液、尿液、母乳、唾液、胸水、腹水、腦脊液等）中。它們由蛋白質、脂質、核酸的特定成分組成，可以將信號傳遞給受體細胞，從而介導細胞間的通訊。外泌體在多種生物學功能中發(fā)揮著重要作用，包括參與RNA、蛋白質、酶和脂質等生物分子的轉移，以及各種生理和病理過程的調節(jié)。

外泌體屬于細胞外囊泡的一種，根據直徑大小以及釋放機制的不同可將細胞外囊泡主要分為外泌體、微囊泡、凋亡小體，它們都參與細胞間信息傳遞，但目前對于外泌體的研究最多。

表 外泌體與其他細胞外囊泡的區(qū)別

圖 外泌體與其他細胞外囊泡

外泌體的結構組成：

外泌體具有脂質雙分子層結構，由膽固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等成分共同組成，在其脂質雙分子層的表面附著有粘附分子、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）、大量的特定蛋白質，包括四跨膜蛋白、熱休克蛋白等等和各種特定的配體（CD9、CD63、CD81等）。在外泌體的內腔中還攜帶各種生物活性物質，包括核酸、某些酶類、蛋白分子、細胞代謝物等，核酸例如信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）、脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）和長鏈非編碼核糖核酸（Longnon-coding ribonucleic acid，LncRNA）等。

圖 外泌體的結構組成

外泌體的功能：

外泌體的功能起決于其所來源的細胞類型。外泌體能夠將核酸、蛋白質和脂質在內的多種生物活性分子從供體細胞轉移到受體細胞，介導細胞間通訊和分子轉運；并且外泌體可以由所有類型的活細胞分泌，在體液中廣泛分布。它可參與機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、細胞遷移、腫瘤侵襲等方面，因此外泌體在生理病理標志物和藥物遞送方面有巨大的應用潛力。

外泌體提取：

進行外泌體研究，首先要將其從樣本中提取出來。目前已有許多基于外泌體物理及生化特性的分離方法，傳統(tǒng)方法包括超速離心、密度梯度離心、超濾、尺寸排阻色譜（size-exclusionchromatography，SEC）、聚合物沉淀法、免疫親和層析，還有一些新的微流體技術、商業(yè)試劑盒。

圖 外泌體分離純化方法合集

超速離心：

超速離心法是最常用也是分離外泌體的“金標準”方法。其原理是利用溶液顆粒大小和密度導致沉降速率不同，來分離不同組分。該方法包含以下步驟：低速離心去除細胞和凋亡碎片；其次以更高離心力消除更大囊泡；最后高速離心沉淀外泌體。該方法操作簡便，可以擴展為大規(guī)模外泌體制備。在過去30年中，超速離心法被廣泛應用于從細胞培養(yǎng)基、血清、體液中分離外泌體。但是該方法特異性不強、可混有分子量相近的蛋白質，同時高速離心力可能破壞外泌體膜泡影響下游分析。

圖 超速離心法分離外泌體

密度梯度離心：

密度梯度離心利用顆粒大小與密度差異對外泌體進行分離。密度梯度離心會預先使用蔗糖或碘克沙醇制作密度梯度。樣品從頂部加入離心管，在離心過程中逐漸自上而下沉降，在一定密度區(qū)間聚集。外泌體通常密度范圍為1.1～1.2g/mL。該方法的局限性是分離樣本容量受到密度區(qū)帶寬度的限制，因此密度梯度離心不便于處理大樣本。

圖 密度梯度離心分離外泌體

超濾：

超濾是基于外泌體尺寸進行分離的方法。根據膜孔的尺寸和截留分子量，將小顆粒通過膜孔進入濾液，大顆粒截留在膜表面。超濾的主要缺點為液體流動方向平行膜孔方向，造成大顆粒堵塞膜孔，同時產生的剪切力也會使外泌體變形或裂解。

圖 超濾法純化外泌體

尺寸排阻色譜（SEC）：

SEC原理為根據顆粒尺寸進行分離。在色譜柱中填充多孔固定相，小顆粒可以穿過固定相中的空隙，因此沉降路徑變長，較大顆粒更晚沉降，因此可以分離尺寸差別較大的顆粒。通常SEC會先進行超速離心預處理以此減少雜質、提高純度。SEC最大的優(yōu)勢是可以很好的保留外泌體活性。

圖 尺寸排阻色譜（SEC）純化外泌體

聚合物沉淀法：

聚合物沉淀原理是利用超親水聚合物，如PEG結合溶液中水分子使溶質溶解度降低進而沉淀析出，最后通過低速離心獲得外泌體。可以廣泛用于各種樣品類型，如血液、培養(yǎng)基、尿液、腦脊液等。其優(yōu)點是可處理大樣本，產量較高。缺點是分離的外泌體會受到其他蛋白質污染。

圖 聚合物沉淀法純化外泌體

免疫親和層析：

免疫親和層析基本原理通過配體與抗體特異結合進而分離純化。一般用外泌體表面生物標記物作為配體，如四跨膜蛋白超家族、囊泡轉運分類內涵體復合物、復合物相關蛋白?？贵w吸附在磁珠、多孔二氧化硅單片板、膜親和過濾器上，溶液通過時可特異結合外泌體表面蛋白進行分離純化。常見方法有基于微孔板的酶聯免疫吸附測定與磁珠免疫捕獲。此類方法具有高特異性，并可以保證外泌體生物活性。

圖 磁珠法免疫捕獲外泌體

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